Bibliographische Beschreibung:
Universität Leipzig, Diss.
151 S., 149 Lit., 17 Tab., 73 Abb., 4 Anlagen
Referat:
Mit der Methode der zeitdifferentiellen gestörten gamma-gamma-Winkelkorrelation(TDPAC) wurden die Multi-Cu-Enzyme Laccase Rhus vernicifera und Ascorbatoxidase Cucurbita medullosa, die zur Familie der blauen Oxidasen gehören und Redoxkatalysatoren sind, sowie die kleinen blauen Cu-Proteine Azurin Pseudomonas aeruginosa und Plastocyanin Spinacea, die als Elektronentransferproteine dienen, untersucht. Dazu wurde das Kupfer via Dialyse aus den Proteinen entfernt und die Apo-Proteine anschließend mit ll1mCd bzw. 199mHg rekonstituiert. Die TDPAC detektiert die elektrische Kernquadrupolwechselwirkung (NQI) der Sonden l11mCd und 199mHg in den Schwermetallderivaten.
Laccase und Ascorbatoxidase enthalten je vier Cu-Atome in drei verschiedenen Koordinationen (ein Typ 1 Cu, ein Typ 2 Cu, zwei Typ 3 Cu; Typ 2 und Typ 3 bilden einen dreikernigen Cu-Cluster), wohingegen die kleinen blauen Cu-Proteine nur ein Typ 1 Cu enthalten.
Temperaturstudien an Azurinmutanten brachten Hinweise für ein "motional narrowing". Die Auswertung der TDPAC-Daten von Plastocyanin und Plastocyaninmutanten mittels Kreuzkorrelationsanalyse lieferte Hinweise auf intramolekulare Flexibilität des Metallzentrums. Gerade bei den kleinen blauen Cu-Proteinen mit ihrem geringen Molekulargewicht von 10 bis 20 kDa ist die langsame Reorientierung der Proteinmoleküle in der hochviskosen Saccharoselösung nachweisbar.
ph-abhängige Studien unterstützen die mit anderen spektroskopischen Methoden ermittelte Koordinationsänderung der Azurinmutante Az(M121E). Eine Variation des pH-Wertes bewirkt nur sehr geringe Änderungen der Kernquadrupolwechselwirkung bei den Mutanten Az(M121Q) und Az(M121D). Die Messungen an Plastocyanin geben keine Hinweise auf eine Koordinationsänderung des Metallzentrums in diesem Protein. pH-Studien an den mit Cd bzw. Hg rekonstituierten Proteinen spiegeln auch die unterschiedliche Stereochemie der eingesetzten Sondenisotope wider. Hg bevorzugt niedrigere Koordinationszahlen als Cd. Änderungen an den axialen Liganden werden deshalb einen geringeren Einfluß auf die 199mHg-NQI haben. Die ph-abhängigen TDPAC-Experimente mit 199mHg-Az(M121E) liefern im Gegensatz zu 111mCd-Az(M121E) keine Hinweise auf eine Koordinationsänderung.
Eine Identifikation der drei verschiedenen Metallkoordinationen in Ascorbatoxidase und Laccase erfolgte im Rahmen von vergleichenden Koordinations- und Blockierstudien anhand ihrer Kernquadrupolwechselwirkung. Mit 111mCd konnten in Laccase in Abhängigkeit vom pH-Wert alle drei Platztypen, in Ascorbatoxidase hingegen nur die Typ 1 und Typ 3 Metallplätze rekonstituiert werden.
Die vermutete Ähnlichkeit der Metallkoordinationen in Laccase und Ascorbatoxidase konnte sowohl für die Cd- als auch für die Hg-Derivate bestätigt werden.